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兔蛋白激酶A(PKA)試劑盒說明書
更新時間:2015-03-24   點擊次數:856次

兔蛋白激酶A(PKA)試劑盒說明書

檢測原理
兔蛋白激酶PKA試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被蛋白激酶A(PKA)抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白激酶A(PKA)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清:使用不含熱原和內毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。

3. 細胞上清液:3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。

5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項

1. 兔蛋白激酶PKA試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶,這屬于正?,F象,水浴加熱使結晶*溶解后再使用。

2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

3. 濃度為0 的S0 號標準品即可視為陰性對照或者空白;按照說明書操作時樣本已經稀釋5 倍,zui終結果乘以5 才是樣本實際濃度。

4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5. 所有液體組分使用前充分搖勻。

洗板方法

1. 手工洗板:甩盡孔內液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min 后甩盡孔內液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5 次。

2. 自動洗板機:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5 次。

操作步驟

1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;

3. 樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。

4. 除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5 次(也可用洗板機洗板)。

6. 每孔加入底物A、B 各50μL,37℃避光孵育15min。7. 每孔加入終止液50μL,15min 內,450nm 波長處測定各孔的OD 值。

結果判斷

繪制標準曲線:在Excel 工作表中,以標準品濃度作橫坐標,對應OD 值作縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。

兔蛋白激酶PKA試劑盒性能

1. 準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關系數R 值,大于等于0.9900。

2. 靈敏度:zui低檢測濃度小于1.0 U/L。

3. 特異性:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4. 重復性:板內、板間變異系數均小于15%。

5. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。

6. 有效期:6 個月

 

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